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篇1：Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定
Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定
目的:构建干扰载体pSilencer 3.1-spl,并初步研究其对Spl基因的干扰作用.方法:根据Spl cDNA编码序列,设计并合成针对Spl基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer 3.1-Hl neo干扰载体中,构建Spl基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体pSilencer 3.1-Spl;分别将阴性对照载体pSilencer 3.1与重组载体pSilencer 3.1-Spl经脂质体LipofectAMINE介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Spl基因的'转录与表达水平.结果:构建了Spl基因siRNA真核表达载体pSilencer 3.1-Spl,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果.结论:特异性siRNA能明显抑制Spl基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Spl的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.
作 者：曲璇 陈苏宁 吴琳 申亮亮 林伟 赵华栋 刘新平张健 QU Xuan CHEN Su-Ning WU LinSHEN Liang-Liang LIN Wei ZHAO Hua-Dong LIU Xin-Ping ZHANG Jian 作者单位：曲璇,吴琳,申亮亮,林伟,赵华栋,刘新平,张健,QU Xuan,WU LinSHEN,Liang-Liang,LIN Wei,ZHAO Hua-Dong,LIU Xin-Ping,ZHANG Jian(第四军医大学,基础部生物化学与分子生物学教研室,国家肿瘤生物学重点实验室,陕西,西安,710032)陈苏宁,CHEN Su-Ning(第四军医大学,基础部生物化学与分子生物学教研室,国家肿瘤生物学重点实验室,西京医院药剂科,陕西,西安,710032)
刊 名：生物技术通讯 ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 19(4) 分类号：Q78 关键词：RNA干扰 Spl基因 小干扰RNA篇2：大鼠CD40基因RNA干扰真核表达载体的构建及鉴定
大鼠CD40基因RNA干扰真核表达载体的构建及鉴定
目的:构建靶向大鼠CD40基因小分子干扰RNA(siRNA)真核细胞表达载体.方法:利用Ambion公司的网上设计工具,设计2个靶向CD40基因的发夹状siRNA,通过化学合成的方法合成2对分别互补的寡核苷酸链,退火后将双链DNA片段连接至pSilencer4.1-CMV neo vector的.多克隆位点,转化扩增提取质粒,对重组质粒进行BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定.结果:经酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定,目的片段与pSilencer4.1-CMV neo vector连接正确,靶向大鼠CD40基因的siRNA重组表达质粒构建成功.结论:成功构建了大鼠CD40基因的RNA干扰真核表达载体pSilencer4.1-CMV-CD40.1和pSilencer4.1-CMV-CD40.2,为进一步研究CD40基因在同种器官移植排斥反应中的作用奠定基础.
作 者：王楠 马庆久 鲁建国 何显力 邹爱民 李坤 WANG Nan MA Qing-jiu LU Jian-guo HE Xian-li ZOU Ai-min LI Kun 作者单位：王楠,马庆久,鲁建国,何显力,WANG Nan,MA Qing-jiu,LU Jian-guo,HE Xian-li(第四军医大学唐都医院普通外科,陕西西安,710038)邹爱民,李坤,ZOU Ai-min,LI Kun(第四军医大学唐都医院中心实验室,陕西西安,710038)
刊 名：医学研究生学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF MEDICAL POSTGRADUATES 年，卷(期)：2008 21(3) 分类号：Q782 关键词：RNA干扰 CD40 重组载体篇3：靶向Nrf2基因RNA干扰真核表达载体的构建
靶向Nrf2基因RNA干扰真核表达载体的构建
目的:利用pSUPER载体构建针对人核因子E2 p45相关因子2(Nrf2)基因的RNA干扰真核表达载体,为研究Nrf2基因在结肠癌化学预防中的作用奠定实验基础.方法:设计特异性针对Nrf2基因的寡核苷酸序列及相应的对照序列,构建重组载体pSUPER-Nrf2转染人结肠癌HT-29细胞.同时转染pEGFP-N1质粒,通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测绿色荧光监测转染效率,共转染pEGFP-N1 48h后G418筛选稳定表达的细胞.RT-PCR和Western blot检测瞬时及稳定转染细胞Nrf2基因的表达,观察稳定筛选出的细胞中UGT1A基因mRNA水平的表达变化.结果:成功构建RNA干扰真核表达载体pSU-PER-Nrf2.转染后24～96 h,荧光显微镜及FCM检测显示转染效率为30%～75%.瞬时转染pSUPER-Nff2-A2,pSUPER-Nrf2-B2重组质粒Nrf2 mRNA的.表达差异无显著性(P＞0.05);瞬时转染72 h及稳定转染后,pSUPER-Nrf2-A1,pSUPER-Nrf2-B1可显著抑制Nrf2基因的表达.RT-PCR检测显示,稳定筛选出的细胞中UGT1A表达水平降低(P＜0.05).结论:成功构建了Nrf2的RNA干扰表达载体,筛选并获得低表达Nrf2基因的稳定克隆,筛选出的细胞UGT1A表达水平明显降低,表明Nrf2可能对UGT1A酶的表达具有调节作用.
作 者：杨晓云 李延青 梁晓红 郭玉婷 袁俊华 张燕 朱强 YANG Xiao-yun LI Yan-qing LIANG Xiao-hong GUO Yu-ting YUAN Jun-hua ZHANG Yan ZHU Qiang 作者单位：杨晓云,李延青,郭玉婷,袁俊华,张燕,朱强,YANG Xiao-yun,LI Yan-qing,GUO Yu-ting,YUAN Jun-hua,ZHANG Yan,ZHU Qiang(山东大学,齐鲁医院消化内科,山东,济南,250012)梁晓红,LIANG Xiao-hong(山东大学,免疫学研究所,山东,济南,250012)
刊 名：山东大学学报（医学版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES) 年，卷(期)： 44(4) 分类号：Q786 关键词：基因,Nrf2 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 RNA干扰 结肠肿瘤篇4：CDC6靶向RNA干扰质粒载体的构建及生物活性鉴定
CDC6靶向RNA干扰质粒载体的构建及生物活性鉴定
目的:构建小鼠CDC6基因的RNAi真核表达载体PGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi,观察其转染小鼠肝细胞前后CDC6的表达变化.方法:根据GenBank中CDC6的序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至PGCsilencer U6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,用脂质体将重组子转染至正常小鼠肝细胞中,用RT-PCR检测CDC6的'mRNA的表达及用Western blot方法检测CDC6蛋白水平的表达,并比较转染前后其表达水平的变化.结果:经测序,模板序列与设计序列完全正确.经过RT-PCR及Western blot方法检测,转染干扰质粒后,小鼠肝细胞中CDC6表达在mRNA及蛋白水平都有明显的下降.结论:成功构建了CDC6基因的RNAi真核表达载体并转染至小鼠肝细胞中,为下一步探讨CDC6在肝再生的作用奠定了基础.
作 者：还勇为 陈平朱瑾 闫洪涛 何中林 陈胤 HUAN Yong-wei CHEN Ping ZHU Jin YAN Hong-tao HE Zhong-lin CHENG Yin 作者单位：还勇为,陈平,闫洪涛,何中林,陈胤,HUAN Yong-wei,CHEN Ping,YAN Hong-tao,HE Zhong-lin,CHENG Yin(第三军医大学大坪医院野战外科研究所肝胆外科,重庆,400042)朱瑾,ZHU Jin(第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所,重庆,400038)
刊 名：现代生物医学进展 ISTIC英文刊名：PROGRESS IN MODERN BIOMEDICINE 年，卷(期)： 7(10) 分类号：Q78 Q813 关键词：CDC6 RNA干扰 质粒 载体构建篇5：人Hepsin基因表达型载体的构建及鉴定
人Hepsin基因表达型载体的构建及鉴定
应用RT-PCR方法从人前列腺癌细胞系LNcap中克隆Hepsin基因全编码序列,并将其克隆入pIRES2-EGFP表达型质粒,应用酶切和测序方法对重组质粒进行鉴定.结果成功克隆人Hepsin基因cDNA序列并构建了重组表达载体.认为含人Hepsin基因表达型载体的构建为Hepsin基因在前列腺癌中的`功能研究提供了实验基础.
作 者：范志强 徐勇 王春雨 关勇 孙建涛 作者单位：范志强,徐勇,关勇,孙建涛(天津市泌尿外科研究所,天津,300211)王春雨(南开大学分子生物学研究所)
刊 名：山东医药 ISTIC PKU英文刊名：SHANDONG MEDICAL JOURNAL 年，卷(期)： 46(15) 分类号：Q3 关键词：Hepsin基因 克隆 逆转录聚合酶链反应 表达型质粒 序列分析 前列腺肿瘤篇6：小鼠MK基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定
小鼠MK基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定
目的:构建小鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的'死亡受体(Mouse killer,MK)基因干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒并在小鼠子宫基质细胞中鉴定其干扰作用.方法:人工合成靶向MK的siRNA干扰序列,将其克隆到穿梭载体psES-HUS上,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-MKsiRNA,在HEK293细胞中包装并扩增腺病毒颗粒.用纯化后的腺病毒混合液感染原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞,RT-PCR及Western Blot检测基质细胞中MK的mRNA及蛋白表达水平.结果:Adeasy-SES-HUS-MKsiRNA混合液均效价为6.8 X 10~(11)pfu/ml,感染原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞48h后,MK的mRNA及蛋白水平均显著下调.结论:构建的MK干扰表达腺病毒能有效地抑制MK基因的表达,为进一步研究MK在小鼠子宫基质细胞的功能提供了有效的工具.
作 者：杨根岭 张晋平徐倩 谭冬梅 赖国旗 谭毅 作者单位：重庆医科大学实验动物中心,重庆,400016 刊 名：重庆医科大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF CHONGQING MEDICAL UNIVERSITY 年，卷(期)： 35(2) 分类号：Q953.5 关键词：Mouse killer基因 RNA 干扰 重组腺病毒 Mouse killer gene RNA interference Recombinant adenovirus篇7：BDNF基因重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-BDNF的构建与鉴定
BDNF基因重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-BDNF的构建与鉴定
目的.构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组逆转录病毒表达载体.方法根据BDNF基因已知序列,设计合成一对引物并导入HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点;从大鼠海马组织提取总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得编码BDNF的基因片段,与克隆载体pMD 18-T Simple连接构建pMDT-BDNF质粒;经HindⅢ、BamH Ⅰ双酶切,获得BDNF基因片断再克隆至逆转录病毒载体pLEGFP-N1中构建重组质粒pLEGFP-BDNF.结果限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子,测序结果证实与已知序列吻合. 结论构建的重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-BDNF含有序列正确的大鼠BDNF基因,可以作为今后治疗老年性痴呆动物模型转基因实验的基因来源.
作 者：李佳楣 龙大宏 冷水龙 罗秀梅 黄文燕 宣爱国 LI Jia-mei LONG Da-hong LENG Shui-long LUO Xiu-mei HUANG Wen-yan XUAN Ai-guo 作者单位：510182,广州,广州医学院人体解剖学教研室 刊 名：中华神经医学杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF NEUROMEDICINE 年，卷(期)： 5(5) 分类号：Q34 关键词：脑源性神经营养因子 逆转录病毒载体 基因重组篇8：健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定
健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定
目的 克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G(apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalytic polypeptide 3G,APOBEC3G)基因cDNA,构建APOBEC3G基因的'真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 采用RT-PER技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因,将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒,并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞,经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况.结果 双酶切鉴定和测序结果表明,APOBEC3G真核表达载体构建成功.免疫细胞化学和Western blot结果均显示,转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达,转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达.结论 成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G,为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础.
作 者：甘宜敏 孔凡运 史震 汤仁仙 郑葵阳 作者单位：徐州医学院病原生物学教研室,江苏,徐州,221002 刊 名：徐州医学院学报 ISTIC英文刊名：ACTA ACADEMIAE MEDICINAE XUZHOU 年，卷(期)：2010 30(4) 分类号：Q789 R394.2 关键词：APOBEC3G 克隆 真核表达载体
