深究DP2干预对大鼠海马神经元的作用论文

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篇1：深究DP2干预对大鼠海马神经元的作用论文

深究DP2干预对大鼠海马神经元的作用论文

铝为地壳中含量最丰富的金属元素，人类日常生活中应用广泛，主要通过食物、化妆品及建筑材料等途径摄入。经证实，长期摄入大剂量铝会产生严重中枢神经系统毒性，表现为行为和认知功能障碍、神经元损伤，甚至神经退行性变，但其具体机制尚不完全清楚。前列腺素(PGs)是一类多不饱和脂肪酸衍生物，由环氧化酶(COX)催化花生四烯酸(AA)代谢产生，介导一系列生理病理过程。前列腺素D2(PGD2)是大脑中最丰富的PGs，其合酶(PGDS)有脑型PGDS(L睵GDS)和生血型PGDS(H睵GDS)两种亚型。在中枢神经系统，除少突胶质细胞外，L睵GDS高表达于神经元。PGD2与特异性受体DP1和DP2结合后，通过受体介导的信号传递机制而发挥广泛作用。DP1和DP2都是G蛋白偶联受体，分别偶联Gs和Gi蛋白，影响环磷酸腺苷(cAMP)水平而发挥不同作用。有研究报道，在PGD2 致原代大鼠皮层神经元损伤模型中，DP2 拮抗剂BAY瞮3405未发挥保护作用，推测DP2 可能不介导PGD2 的神经毒性。另也有研究报道，在谷氨酸致原代大鼠海马脑片损伤模型中，DP2激动剂DK睵GD2明显升高神经元的LDH漏出率及细胞死亡率，提示DP2介导PGD2的神经毒性。出现此矛盾结果，可能与研究模型不同有关。DP2作为DP受体中的一员，在铝盐致原代培养大鼠海马神经元损伤过程中具体是如何变化的，尚未见报道。目前广泛研究的DP2选择性激动剂主要有DK睵GD2、15d睵GD2、15d睵GJ2，DP2 选择性拮抗剂主要有CAY10471、AM461、AZD1981。参考Yue等的报道，我们选择DK睵GD2、CAY10471作为干预药物进行实验。我们前期实验结果表明，铝负荷原代培养大鼠海马神经元损伤模型中，L睵GDS表达明显上调，DP2表达明显下调，PGD2 含量明显升高，初步提示L睵GDS睵GD2睤P2信号通路可能参与了神经元损伤过程。在本实验中，我们采用DP2选择性激动剂和拮抗剂分别干预铝负荷神经元，进一步观察DP2在原代培养大鼠海马神经元中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取孕期18d左右的SD大鼠，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证书号：SCXK(渝)-0002。

1.1.2 主要试剂与仪器 麦芽酚(阿拉丁，上海)，DMEM/F12、D睭ank′s(Hyclone，美国)，B27、Neuro瞓asal培养基、胎牛血清(Gibco，美国)，左旋多聚赖氨酸、MTT试剂盒(Sigma，美国)，青霉素-链霉素溶液、LDH试剂盒、Fluo3AM(碧云天，上海)，山羊抗兔特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体(博士德，武汉)，SP试剂盒、DAB显色剂(中杉金桥，北京)，苏木精染液、伊红染液(南京建成，南京)，DK睵GD2、CAY10471(Cayman，美国)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，二氧化碳培养箱(ThermoSci瞖ntific，美国)，超纯水系统(Millipore，美国)，低温冷冻离心机(ThermoScientific，美国)，激光扫描共聚焦显微镜(Bio睷ad，美国)，全自动酶标仪(BioTek，美国)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海马神经元原代培养 取孕期18d左右的SD大鼠，断颈后迅速剪开腹部皮肤和腹膜，将子宫完全暴露后剪断肌层和脐带，取出胎鼠并立即浸泡于装有75%乙醇的烧杯中。约30s后，将消毒好的胎鼠移入事先准备的D睭anks液中，断头取脑，迅速分离出两侧完整海马，放入冰浴的D睭anks液中，用眼科剪将海马组织剪碎。加入组织体积5倍左右的0125%胰酶，混匀，37℃培养箱内消化，10min时拿出轻轻吹打数次。20min后，加入同体积的含10%胎牛血清培养液终止消化。200目细胞网筛过滤，收集细胞悬液，800r·min-1离心10min。弃去上清，加入一定量的含10%胎牛血清培养液重悬细胞，制成细胞密度为1×106·L-1的细胞悬液。吸取不同体积细胞悬液分别接种于左旋多聚赖氨酸包被好的培养板、培养皿及培养瓶中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。4h后，待神经元贴壁，换含2% B27的Neurobasal培养液继续培养，以后每隔3d半量换液1次。海马神经元培养至d7时长到较好状态，可进行后续实验。

1.2.2 原代培养大鼠海马神经元的免疫化学鉴定 取6孔培养板中培养至d7的海马神经元爬片(10mm×10mm)，弃去细胞培养液用PBS漂洗3次;4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次，每次2min;3% H2O2 孵育15min，PBS漂洗3次，每次2min;10%山羊血清封闭，37℃孵育20min，吸干血清，不漂洗;NSE多克隆抗体∶抗体稀释液(1∶50)，以PBS代替一抗设空白对照，4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5min;生物素标记山羊抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS漂洗3次，每次5min;辣根酶标记链霉素卵蛋白素工作液，37℃ 孵育30min，PBS漂洗3次，每次5min;避光条件下，DAB显色10min，自来水终止反应;苏木精染液复染细胞核，3min后自来水返蓝;95%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片;晾干，镜下观察。

1.2.3 MTT测定 将96孔培养板中大鼠海马神经元培养至d7进行实验分组，即空白对照组(300μmol·L-1maltol)、铝负荷模型组[100μmol·L-1Al(malt)3]、干预组(Al3+ +10-5、3×10-6、10-6mol·L-1 DK睵GD2、CAY10471)。在加入处理因素后继续培养24h，每孔加入20μL的MTT溶液(5g·L-1)，37℃培养箱中孵育4h。弃去孔内上清液，加入150μLDMSO，摇床上避光震荡，以充分溶解结晶物，于570nm波长处测定吸光度值(OD值)。

1.2.4 乳酸脱氢酶(LDH)漏出率测定 将24孔培养板中大鼠海马神经元培养至d7进行实验药物处理(分组同“1.2.3”)，继续培养24h后，根据LDH测定试剂盒说明书具体步骤操作，于490nm波长处测定OD值。计算公式：细胞毒性或LDH漏出率/% =(处理样品OD值-样品对照孔OD值)/(细胞最大酶活性的.OD值-样品对照孔OD值)×100。

1.2.5 海马神经元病理形态学观察 将24孔培养板中大鼠海马神经元爬片(10mm×10mm)培养至d7进行实验分组，即空白对照组(300μmol·L-1mal瞭ol)、铝负荷模型组[100μmol·L-1Al(malt)3]、干预组(Al3+ +10-5mol·L-1DK睵GD2、CAY10471)。在加入处理因素后继续培养24h，弃去细胞培养液，PBS漂洗3次，每次1min;4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次;HE染色，镜下观察。

1.2.6 Ca2+荧光强度测定 将共聚焦专用培养皿中大鼠海马神经元培养至d7进行药物处理(分组同“1.2.5”)，继续培养24h。弃去培养皿中培养液，采用Ca2+荧光探针Fluo3/AM标记活细胞内Ca2+，通过激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内Ca2+荧光强度。1.2.7 统计学分析 所有实验结果均以珋x±s表示，采用SPSS17.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析及Dunnett′st检验。

2 结果

2.1 原代培养大鼠海马神经元NSE免疫化学鉴定 培养至d7的神经元，在倒置光学显微镜下观察，其胞体饱满有光晕，轴突和树突明显，突起交错连接成网状。经NSE免疫细胞化学染色后，阳性细胞胞体及突起呈棕黄色;苏木精复染后，阳性细胞胞核呈蓝色。随机取6个视野，每个视野挑选100个细胞，计数NSE阳性细胞并计算其所占百分比。统计结果显示，超过95%为阳性细胞(Fig1)。

2.2 DP2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元存活力的影响

2.2.1 DK睵GD2对铝负荷原代培养大鼠海马神经元存活力的影响 与空白对照组比较，铝负荷模型组MTT值明显降低(P<001);与铝负荷模型组比较，DK睵GD2干预组MTT值明显降低，且有剂量依赖性。

2.2.2 CAY10471对铝负荷原代培养大鼠海马神经元存活力的影响 与空白对照组比较，铝负荷模型组MTT值明显降低(P<001);与铝负荷模型组比较，CAY10471干预组MTT值明显升高，且有剂量依赖性。

2.3 DP2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元LDH漏出率的影响

2.3.1 DK睵GD2对铝负荷原代培养大鼠海马神经元LDH漏出率的影响 与空白对照组比较，铝负荷模型组LDH漏出率明显升高(P<001);与铝负荷模型组比较，DK睵GD2 干预组LDH漏出率明显升高，10-5mol·L-1、3×10-6mol·L-1组差异有显著性(P<001。

2.3.2 CAY10471对铝负荷原代培养大鼠海马神经元LDH漏出率的影响 与空白对照组比较，铝负荷模型组LDH漏出率明显升高(P<001);与铝负荷模型组比较，CAY10471干预组LDH漏出率明显降低(P<001)。

2.4 DP2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元病理形态学的影响 HE染色后，在正置光学显微镜下观察，空白对照组海马神经元结构清晰完整，胞体呈锥形或三角形，核仁明显，有双极或多极突起并相互交织成网;铝负荷模型组海马神经元细胞数目明显减少，突起萎缩，部分细胞核固缩;DK睵GD2干预组海马神经细胞几乎全部核固缩、裂解;CAY10471干预组海马神经元较模型组神经元结构完整，胞体、胞核明显，裂解细胞明显减少(Fig2、3)。

2.5 DP2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元Ca2+荧光强度变化的影响 空白对照组海马神经元的Ca2+荧光强度极其微弱，铝负荷模型组Ca2+荧光强度明显增强(P<001);与铝负荷模型组比较，DK睵GD2干预组Ca2+荧光强度有增强趋势，但差异无显著性;CAY10471干预组Ca2+荧光强度明显降低(P<001)(Tab5、Fig4)。

3 讨论

铝作为一种公认的神经毒剂，过量蓄积可严重影响人的认知功能，进而诱发一系列神经系统疾病。与三氯化铝、葡萄糖酸铝等其他铝盐相比，麦芽酚铝[Al(malt)3]是一种中性含铝复合物，在生理pH条件能释放出大量Al3+，有利于进行铝负荷神经毒性的相关研究。本实验采用Neurobasal培养基(含2% B27)进行海马神经元的原代培养，通过神经元胞质内特异性标志物NSE的鉴定，其纯度超过95%。参考Chen等[11]并通过我们的前期实验摸索，本实验采用100μmol·L-1麦芽酚铝建立铝负荷大鼠原代海马神经元损伤模型。研究结果发现，与空白对照组比较，铝负荷原代培养大鼠海马神经元MTT值明显降低、LDH漏出率明显升高、Ca2+荧光强度明显增强，海马神经细胞数目明显减少、突起萎缩，部分细胞核固缩。Chen等[12]对麦芽酚铝致原代培养的大鼠皮层神经元损伤进行了研究，发现Al3+通过激活Rho睷ock信号通路诱导神经毒性。Johnson等[13]在原代培养的大鼠海马神经元中发现，麦芽酚铝可造成神经元呈时间和剂量依赖性凋亡，其作用机制可能与麦芽酚铝抑制脑源性神经生长因子(BDNF)，导致细胞内Ca2+升高有关。

我们实验结果还发现，与铝负荷模型组相比，DK睵GD2干预组MTT值明显降低、LDH漏出率明显升高、Ca2+荧光强度有增强趋势，海马神经细胞几乎全部核固缩、裂解;CAY10471干预组MTT值明显升高、LDH漏出率明显降低、Ca2+荧光强度明显减弱，海马神经元较模型组神经元结构完整，胞体、胞核明显，裂解细胞明显减少。有研究报道，DP2 偶联Gi蛋白，通过激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Ser50/Thr145)，激活糖原合成酶3(GSK3)，活化T细胞核因子的转换，释放炎性介质。也有研究报道，DP2被激活后偶联Gi蛋白，抑制cAMP水平，促进Ca2+ 内流，上调CD11b表达，诱导嗜碱性粒细胞迁移和脱颗粒，促进IL2、IL4、IL5、IL13的释放。Liang等[5]对天冬氨酸(NMDA)致原代海马神经元损伤进行了研究，发现DK睵GD2 加重神经元损伤。Schroder等[16]对炎性相关因子前列腺素H1(PGH1)进行了研究，发现CAY10471可抑制Th2细胞的迁移。结合本实验结果，DK睵GD2可能通过激动DP2，偶联Gi蛋白，增加细胞内Ca2+浓度，加重铝负荷原代培养大鼠海马神经元损伤;CAY10471可能通过抑制DP2活性，减少Ca2+流入，对铝负荷原代培养大鼠海马神经元损伤起一定保护作用。

综上所述，DP2 激活表达可增加神经元对铝盐损伤的易感性，其机制可能涉及DP2下游Ca2+信号通路的调控，但由于作用复杂，在神经系统中的机制尚不完全清楚。因此，在本研究的基础上，可对DP2在神经系统中介导的下游Ca2+信号通路的具体调控机制进行深入研究。

篇2：蛋白激酶在缺血大鼠海马神经元细胞中的保护作用论文

蛋白激酶在缺血大鼠海马神经元细胞中的保护作用论文

研究发现，缺血再灌注损伤是对组织造成损伤的主要因素，即再次恢复血液供应，缺血组织灌注时造成的微血管和实质器官的损伤，本研究旨在探讨糖皮质激素诱导的蛋白激酶1( SGK1) 在大脑缺血再灌注过程中可能的保护机制。

1 资料和方法

1. 1 样本来源本研究用细胞为培养后的1 日龄SD 大鼠神经元细胞。对SD 大鼠采用椎脱臼处死法处死，用75% 酒精浸泡消毒3 ～ 5 min; 取出海马神经元细胞进行培养。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 大鼠海马神经元细胞的额分离及培养选用1 日龄SD大鼠2 只。通过对大鼠进行消毒后处死，获取了SD 大鼠的海马细胞，并进行了体外培养。

1. 2. 2 已分离培养的SD 大鼠海马神经元细胞的免疫荧光鉴定采用海马神经元特异性抗微管相关蛋白2(MAP2) 抗体免疫荧光来显示分离和培养的结果，在显微镜下计数，记录每个视野中染色阳性的细胞占所有细胞的比值，超过95%的为阳性。

1. 2. 3 通过氧糖剥夺诱导海马神经元凋亡将海马神经元细胞根据氧糖剥夺诱导时间不同分为正常海马神经元细胞组，氧糖剥夺诱导120 min 组、氧糖剥夺诱导120 min 后正常恢复10 min组、氧糖剥夺诱导120 min 后正常恢复30 min 组和氧糖剥夺诱导120 min 后正常恢复60 min 组。采用Annexin VFITC/PI 流式细胞术对样品进行检测，区分实验样本中正常、坏死、凋亡细胞。

1. 2. 4 Western 印迹技术检测上述步骤中各种细胞的SGK1 表达实验对样本进行总蛋白提取与定量，根据SGK1 的mRNA序列( 序列号: NM_001193568. 1) 设计了该基因的全基因引物，获得目的基因SGK1 模板，构建质粒载体，并进行过表达效率检测。

1. 3 统计学方法采用SPSS16. 0 进行分析。

2 结果

2. 1 氧糖剥夺诱导海马神经元凋亡及SGK1 表达情况NC 代表未经任何处理的培养过的SD 大鼠海马神经元细胞、OGD 表示对培养过的'SD 大鼠海马神经元细胞进行了120 min 的氧糖剥夺，而10 min 组、30 min 组和60 min 组则表示培养过的SD 大鼠海马神经元细胞在进行了120 min 的氧糖剥夺之后分别进行了10 min、30 min 和60 min 的氧糖正常供给。

2. 2 SGK1 基因蛋白水平的过表达能阻止氧糖剥夺120 min 的培养过的SD 大鼠海马神经元细胞的凋亡与NC 组比较，转染SGK1 过表达载体的细胞内，可以SGK1 导致mRNA 的表达增加约5 倍; 在转染了SGK1 过表达病毒载体的细胞中，SGK1 基因在蛋白水平的表达约超过未处理组的2. 5倍。海马神经元分别转染了空载体或编码SGK1 基因的表达载体; 在转染24 h 后，

SGK1 在基因水平和蛋白质水平的变化情况和NC 相比具有显著性差异。海马神经元分别转染了空载体或编码SGK1 基因的表达载体24 h，然后进行120 min 的氧糖剥夺，然后使之恢复60 min; 运用流式细胞仪分析用膜联蛋白V/PI 双染色法来检测细胞凋亡情况。通过免疫印迹实验检测SGK1 和活化的金属基质蛋白酶(caspase) -3 蛋白水平差异情况。

3 讨论

缺血性脑血管病是目前导致人类，尤其是老年人致死和致残率最高的疾病之一。对于缺血性脑血管病当前最主要的治疗原则是对缺血区域进行血液灌注; 然而近期发现对缺血性脑血管疾病的缺血再灌注非但没有使组织功能恢复，反而会导致缺血所致的功能障碍和结构破坏进一步加重，这种现象即缺血再灌注损伤，在各种模式生物和人类研究中都得到了一致的结果。

本研究结果发现，对体外培养的SD 大鼠海马神经元细胞进行氧糖剥夺可导致SD 海马神经元细胞凋亡数量的增加，而之后随着再恢复氧糖供应时间的增加，神经元细胞凋亡的数据则呈现进一步加剧的趋势。而SGK1 的过表达则可以抑制SD大鼠海马神经元细胞因氧糖剥夺导致的细胞凋亡的趋势。另外本结果显示，SGK1 的过表达能显著降低因氧糖剥夺导致的SD 大鼠海马神经元细胞凋亡的数量，这一结果得到了荧光辅助细胞筛选分析的支持，提示Akt 和GSK-β 可对经受缺血再灌注海马神经元细胞能起到保护作用。

篇3：晚期糖化终末产物对大鼠海马神经元的损伤作用与机制

晚期糖化终末产物对大鼠海马神经元的损伤作用与机制

目的 研究晚期糖化终末产物(AGEs)对海马神经元存活、生长的影响和机制,以探讨AGEs在阿尔茨海默病发生中的作用.方法 取培养1 d的新生大鼠海马神经元,分为对照组和AGEs-BSA组.在含终浓度为100 mg・L-1、500 mg・L-1、2 000 mg・L-1的'牛血清白蛋白(BSA)或AGEs-BSA的培养液中培养24 h,显微镜下观察神经元形态变化,噻唑蓝(MTT)法测定神经元存活率,硫代巴比妥法测定神经元脂质过氧化物(LPO)含量.结果 100 mg・L-1BSA或AGEs-BSA条件下,2组海马神经元的形态、存活率及LPO含量均无明显差异(P>0.05).500 mg・L-1和2 000 mg・L-1条件下,AGEs-BSA组的海马神经元生长状况均较差,细胞存活率均降低(P<0.05,P<0.01),LPO含量均升高(P<0.05,P<0.01),且2 000 mg・L-1组上述变化更显著(P<0.01).结论 AGEs对体外培养的海马神经元有剂量依赖性损伤作用.过氧化应激是AGEs损伤海马神经元的途径之一.

作 者：赵长安 王悦芬 郭丽 许娜 李恩  作者单位：赵长安,郭丽(新乡医学院生物化学与分子生物学教研室,河南,新乡,453003)

王悦芬,李恩(河北医科大学中西医结合研究所,河北,石家庄,050017)

许娜(新乡医学院形态学实验室,河南,新乡,453003)

刊 名：新乡医学院学报  ISTIC英文刊名：JOURNAL OF XINXIANG MEDICAL COLLEGE 年，卷(期)： 25(3) 分类号：Q591.4 关键词：晚期糖化终末产物   海马   神经元   脂质过氧化物  

篇4：金纳多合阿米洛利对大鼠肝纤维化模型的干预作用论文

金纳多合阿米洛利对大鼠肝纤维化模型的干预作用论文

【摘要】  目的 观察银杏叶提取物金纳多合阿米洛利对大鼠肝纤维化模型的干预作用。方法 以二甲基亚硝胺造成大鼠肝纤维化模型，分别观察金纳多与阿米洛利干预后，羟脯氨酸、透明质酸及层粘连蛋白含量的变化。结果 各给药组（除阿米洛利组外）大鼠肝功能均较模型组有明显改善；阿米洛利和金纳多给药组较模型组的血清透明质酸、层粘连蛋白和肝组织羟脯氨酸含量降低(P<0.05)；肝组织内SOD较模型组升高，而MDA低于模型组(P<0.01)；金阿合用组效果最佳。结论 金纳多(银杏叶提取物)与阿米洛利对二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化模型均有预防作用，两者合用有一定的协同作用。

目前认为，肝纤维化可以预防和逆转。近年来，已有不少学者以干扰肝纤维化形成过程中某一因素来干扰肝纤维化的发展，取得了一定成绩。由于肝脏纤维化的发生发展是一个复杂的过程，有诸多因素参与，因此仅干扰其中某一因素效果并不理想。新近关于肝纤维化形成机制的研究表明氧应激和交换泵在肝纤维化形成中起重要作用[1,2]，为抗肝纤维化的研究提供了新靶点。本实验通过建立二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型，观察联用Na+/H+交换泵抑制剂阿米洛利（Amiloride）与抗氧化剂银杏叶提取物金纳多[3]（Ginaton）联用对大鼠纤维化形成的影响，以探索临床抗肝纤维化的新途径。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1  材料

1.1.1  动物  雄性SD大鼠，体质量（180±30）g，购于湖南中医学院实验动物中心，合格证号：SCXK（湘2002-003）。

1.1.2  药物  阿米洛利，1 g/瓶，购自Sigma公司；金纳多(银杏叶提取物)，5 g/瓶，由德国威玛舒培大药厂生产；二甲基亚硝胺，100 mL/瓶，购于TCI公司。

1.1.3  仪器  752-紫外分光光度计上海第三分析仪器厂，LD5-2A离心机北京仪器厂，AA-160型电子天平德国Denver公司，SN-862型放射免疫γ计数器上海分析仪器厂。

1.1.4  试剂  超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒为南京建成生物制品公司产品；透明质酸（HA）和层粘连蛋白(LN)放免试剂盒购自上海海军生物医学研究所。

1.2  方法

1.2.1  动物分组与造模  模型建立参照文献[4]。雄性SD大鼠60只，体质量150～210 g，随机分为6组，即正常组、模型组、阿米洛利组、金纳多组、金纳多+阿米洛利组（简称金阿合用组）、马络替酯组，每组10只。其中模型组及给药组每周连续3 d腹腔注射二甲基亚硝胺10 mg/kg,共3周；各给药组造模同时每日分别经胃灌注阿米洛利(1 mg/kg)、金纳多(40 mg/kg)、金阿合用组（与单用组浓度相同），共用药3周；马络替酯组造模同时每日经灌胃马洛替酯[5]（90 mg/kg）；正常对照组每周连续3 d腹腔注射生理盐水，共3周，同时每日灌胃生理盐水共3周。第4周初，摘眼球采血后处死动物，剪下完整肝脏组织标本，称肝质量后取部分中叶肝脏以10%中性甲醛固定，3 d内石蜡包埋，备病理检测；将余下肝脏于液氮中速冻，备肝组织匀浆测组织MDA、SOV、羟脯氨酸、透明质酸及层粘连蛋白，血清于-70 °C冰箱内保存备肝功能检测。

1.2.2  肝功能、脂质过氧化指标检测  MDA、GSH-PX、SOD HA及LN均按试剂盒说明测定。肝组织羟脯氨酸测定参照李文才等[6]的方法。

1.3  统计学分析

计量资料以均数±标准差(x±s)表示， 用统计软件SPSS10.0进行单因素变量的方差分析和最小差值显著法（LSD）的两两比较。

2 结果

2.1  一般情况

正常对照组大鼠一般状态良好；模型组活动少，皮毛欠光滑，尿色黄，有腹泻。各给药组大鼠精神活跃，毛发光滑，体型丰满，无腹泻。

2.2  肝功能指标检测

如表1所示：与正常组比较，模型组谷丙转胺酶（ALT）和碱性磷酸酶（AlP）的水平明显升高，白蛋白、球蛋白比（A/G）的水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；除了阿米洛利组外，其它给药组ALT和AlP显著低于模型组，而A/G显著高于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）；对ALT和A/G的影响金阿合用组优于阿米洛利单用组，差异有统计学意义（P<0.01）；对AlP的影响合用组优于两单用组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

2.3  脂质过氧化指标

由表2可见：与正常组比较，模型组MDA的水平明显升高，而SOD的活力明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，给药组不同程度明显扭转MDA和SOD，差异有统计学意义（P<0.01）；对MDA的影响金阿合用组优于各单用组，差异有统计学意义（P<0.05），对SOD的影响金阿合用组优于金纳多单用组，差异有统计学意义（P<0.05），但不优于阿米洛利单用组。见表2。

2.4 对大鼠肝纤维化程度的影响

由表3可见：与正常组比较，模型组HA、LN和 HYP的含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；各给药组不同程度明显降低HA、LN和HYP的含量，差异有统计学意义（P<0.05）；对HA和LN的影响，金阿合用组优于各单用组，差异有统计学意义（P<0.05）；对HYP的影响，金阿合用组并不优于单用组。见表3。

3 讨论

本实验的研究表明， 阿米洛利与金纳多对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化具有明显的预防作用。肝功能检测提示金纳多可减轻肝细胞的变性和坏死，并改善肝细胞功能，1 mg/kg的阿米洛利无此功效，表现为除了阿米洛利组，其余各组谷丙转氨酶和碱性磷酸酶较模型组显著降低(P<0.001)，白蛋白、球蛋白比显著升高(P<0.001)。胶原纤维主要由胶原蛋白所构成，Hyp为胶原蛋白所特有的氨基酸成分，其在肝脏中的含量可反映胶原代谢的变化情况，与肝纤维化程度相平行。本研究通过检测肝组织匀浆Hyp的含量发现，金纳多与阿米洛利均可降低Hyp的含量，说明阿米洛利与金纳多均可抑制胶原的.生成和沉积。氧化应激及脂质过氧化是引起肝细胞损伤与肝星状细胞活化的重要机制[7]。通过检测肝组织匀浆中SOD、MDA含量发现，各给药组的SOD较模型组显著升高，而MDA显著降低，说明金纳多有直接降低自由基生成，减轻脂质过氧化的作用。而阿米洛利可能是通过抑制肝星状细胞激活、增殖及转型，从而减轻脂质过氧化的作用。对SOD、MDA的影响，合用组优于单用组，说明两者在抗脂质过氧化方面可能有协同效应。肝星状细胞活化为类肌成细胞，大量合成和分泌细胞外基质是肝纤维化形成的中心环节。本研究通过检测HA和LN的水平发现，金纳多与阿米洛利均可降低HA和LN的水平，尤以合用组最低，说明金纳多与阿米洛利可以抑制肝星状细胞活化，抑制细胞外基质的合成和分泌。总之，金纳多保护肝细胞及抑制肝星状细活化的作用与阿米洛利抑制肝星状细胞活化的作用可能正是它们合用效果更佳的原因。

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